Biologinio atsako į radijodažninės abliacijos terminį poveikį tyrimas ir kompiuterinis modeliavimas (BIOTHERM)

Biologinio atsako į radijodažninės abliacijos terminį poveikį tyrimas ir kompiuterinis modeliavimas. Projekto tikslas - atlikti išsamų eksperimentinį ir matematinį kepenų navikų lokalios radijo dažninės abliacijos proceso tyrimą ir apibūdinti biologinį hepatocitų ląstelinio bei subląstelinio lygmens energetinio aparato atsaką į juo sukurtą hipertermiją. COMSOL Multiphysics baigtinių elementų terpėje sukurtas RDD proceso modelis, aprašantis susietus elektros srovės, šilumos laidumo ir perdavimo infiltruojamu fiziologiniu tirpalu reiškinius. Tyrimo eigoje buvo patikslinti kepenų audinio hidraulinės talpos bei hidraulinio laidumo koeficientai, o šiluminio ir elektrinio laidumo koeficientų reikšmės masteliuojamos įvertinant nagrinėjamu laiko momentu turimą audinio tūrinę soties dalį dėl jo užpildymo fiziologiniu tirpalu. Įvertinus perfuzijos koeficiento priklausomybę nuo audinių pažeidimo integralo laipsnio, buvo patikslintas šilumos galios praradimo gyvuose audiniuose dėl kraujo perfuzijos modelis. Modelis buvo eksperimentiškai patvirtintas atliekant RDD eksperimentus negyvuose ir gyvuose kepenų audiniuose normalios ir sulėtintos ar sustabdytos kraujotakos sąlygomis. RDD proceso in-vivo savybės stambių kraujagyslių aplinkoje ištyrimui buvo sukurtas tūrinis modelis. Temperatūros kraštine sąlyga kraujagyslės paviršiuje priimta žinoma temperatūra, lygi normaliai audinių temperatūrai. Tai konservatyvus modelis, kadangi kraujagyslės sienelių temperatūra tokiu būdu priimama šiek tiek mažesnė, nei galėtų būti tikrovėje. Atlikus skaičiavimus, buvo kiekybiškai įvertintas temperatūros ir nekrozės zonų sumažėjimas bei iškreivinimas dėl šilumos nuvedimo kraujagysle tekančiu krauju. Atlikę eksperimentinius RDD tyrimus gyvame audinyje nustatėme, kad santykinio pa?eidimo zonoje yra aktyvi Kaspazė 3 (17 kDa subvienetas). Mūsų tyrimas patvirtino hipotezę, kad jau po valandos nuo terminio poveikio, kuris tesiekia 50 laipsnių Celsijaus yra aktyvuojama apoptozė. Imunohistocheminiu tyrimu nustatėme, kad reliatyvios destrukcijos zonoje 10-15 mm atstumu nuo aktyvaus elektrodo aktyvuojama apoptozė. Apoptozė yra aktyvi did?iojoje dalyje hepatocitų, nutolusių 10 mm nuo centrinės zonos krašto. Distaliau apoptozės mastas ma?ėja, galiausiai apoptozė nestebima normaliose kepenyse 20 mm nuo centrinės zonos krašto Stambios kraujagyslės aplinkoje, esant aušinamąjam efektui, apoptotinių ląstelių kiekis mažėja, tuo pačiu išnyksta ir "saugi" onkologiniu požiūriu audinių abliacijos zona. Siekiant suprasti procesus, vykstančius ląstelėse bei galimas vėžio atsinaujinimo priežastis, jas kaitinant gydymo tikslais, svarbu nustatyti esminius tam tikru nuotoliu nuo terminio naikinimo srities nutolusių audinių ląstelių med?iagų apykaitos būklės ir gyvybingumo rodiklius. Nustatėme, kad hipertermija sukelia progresuojančius izoliuotų kepenų mitochondrijų funkcijų pokyčius: didina kvėpavimo greitį antrojoje ir slopina trečiojoje metabolinėse būsenose. Šis poveikis priklauso nuo lyties: patelių mitochondrijos yra ma?iau jautrios viršfiziologinei hipertermijai (41-43 oC), tačiau grubi hipertermija (44-46 oC) stipriai slopina ir atskiria oksidacinį fosforilinimą ir patelių, ir patinų mitochondrijose. Gauti žiurkės kepenų mitochondrijų diferencinės skenuojamosios kalorimetrijos rezultatai, kad keliant temperatūrą faziniai virsmai prasideda 40 ºC temperatūroje. Fazinis virsmas 48ºC temperatūroje gali lemti kepenų mitochondrijų membranos barjerinės funkcijos praradimą ir substrato oksidacijos atskyrimą nuo ADP fosforilinimo esant auk?tesnei nei 45ºC temperatūrai. Santykinai trumpa (15 min.) 42°C ir aukštesnės temperatūros kepenų perfuzija ženkliai ir negrįžtamai slopina mitochondrijų kvėpavimo grandinės ir, greičiausiai, fosforilinimo posistemės sandų aktyvumą, 46°C temperatūros perfuzija didina membranos laidumo posistemės aktyvumą, o po 52°C perfuzijos kepenų mitochondrijos visiškai praranda energetines funkcijas ir net gali pradėti veikti ląstelės energijos išteklių sekinimo kryptimi. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti NAD(P)H (taip pat vienu metu ir AMP, ADP, ADP-ribozės, ATP) koncentracijas kepenų audinio biopsijų ekstraktuose. Bendras adenino nukleotidų ir redukuotų piridino dinukleotidų kiekio sumažėjimas stebimas tik esant aukštesnei nei 50°C perfuzijos temperatūrai. Atlikta adenino ir piridino nukleotidų chromatografinė analizė hepatocitų ekstraktuose atskleidė didesnį hepatocitų jautrumą temperatūrai, lyginant su audiniu, ir skirtingą patinų ir patelių hepatocitų atsaką į hipertermiją: patelių hepatocitus inkubuojant 40ºC temperatūroje, ATP/ADP santykis 5 padidėjo apie 2,6 karto, NADH/NAD+ santykio sumažėjo 1,7 karto, tai gali būti paaiškinama patelių kepenų mitochondrijų kvėpavimo grandinės (NADH oksidacijos) aktyvinimu 40ºC temperatūroje, kas lemia ATP kiekio padidėjimą ląstelėje ir bendros energetinės būsenos pagerėjimą. Auk?tesnėse temperatūrose stebimas energetinių resursų sekinimas, kuris patinų hepatocituose prasideda jau nuo 40ºC temperatūros. Nustatyta, kad hepatocitų gyvybingumas tiesiogiai koreliuoja su hepatocitų NAD(P)H fluorescencija ir chromatografiškai nustatytu NAD(P)H kiekiu. Parodyta, kad kepenų audinio paviršiaus NAD(P)H fluorescencija tiesiogiai priklauso nuo audinio NAD(P)H kiekio. Tai leidžia teigti, kad neinvazyvūs tiesioginiai NAD(P)H fluorescencijos matavimai gali būti vertingu rodikliu įvertinant hipertermijos sukeltus gyvybingumo kitimus. 6 Summary Project title: Investigation of biological response to thermal impact and computational modelling. Aim of study: to perform detailed study is to perform detailed experiemntal and computational analysis of the effect of local radiofrequency ablation on normal (non-diseased) liver tissue and to describe biological response of hepatocytes in the cellular and subcellular levels. Axisymmetric finite element model of radiofrequency ablation (RFA) with cooled-tip probe in liver, which describes coupled electric, thermal and sodium chloride solution infiltration flow processes has been developed by employing COMSOL Multiphysics software. In process of investigation hydraulic capacity and permeability coefficients of liver tissue have been specified. Heat transfer caused by blood flow has been described by means of mathematically derived perfusion coefficient. The model has been validated by computational and experimental investigations of RFA processes in live liver tissues and in live liver tissues with suppressed blood flow. For investigation of RFA in-vivo in the vicinity of large blood vessels the 3D finite element model has been developed. The temperature boundary condition at the surface of the blood vessel the prescribed normal tissue temperature value has been employed. The model can be regarded as a conservative one as the assumed temperature is lower than could be expected in reality. The investigations revealed the reduction of high temperature and dead cells zones caused by the heat transfer by the blood flow. Experiments carried out on viable liver tissue revealed the active (cleaved) caspase-3 17-kDa subunit in the transition zone. Our investigation has supported the hypothesis that apoptosis is being activated in one hour after limited hyperthermia of aound 500 C. Moreover, activation of apoptosis was confirmed by immunohistochemistry. The elucidation of the molecular mechanism of the cell response to heating is of importance for understanding the events (cell viability and methabolic changes, tumour recurrence) that occur in tissue located in various distance areas from thermal ablation source. We determined the progressive effect of hyperthermia on the functions of isolated mitochondria manifesting by increasing state 2 and inhibiting state 3 respiration rate. This effect is gender-dependent: mitochondria from female rat are less sensitive to supra-physiological temperature (41-43 oC) than those of male mitochondria. Rough hyperthermia (44-46 oC) has strong inhibiting and uncoupling effect on oxidative phosphorylation in both, female and male, mitochondria. Detected phase transitions of mitochondria with onset temperature 40 oC may influence the loss of barrier functions and uncoupling of oxidative phosphorylation in temperature exceeding 45 oC. 42 °C and higher temperature liver perfusion markedly and irreversibly inhibits the activity of respiratory chain components and, probably, phosphorylation module components, 46 °C liver perfusion activates membrane leak subsystem, finaly 52 oC perfusion mitochondria completely lose their energy suply functions and could even start depleting cellular energy. The total amount of adenine nucleotides and reduced pyridine dinucleotides determined by HPLC in liver tissue is decreasing only after 50 oC perfusion, while in hepatocytes, it starts to decrease already at 40 oC (in male). It shows not only higher temperature sensitivity of hepatocytes compared to tissue, but also gender-dependent response: at 40 oC in female hepatocytes the ATP/ADP ratio increased by 2.6 fold, NADH/NAD+ ratio decreased by 1.7 fold, what could be explaned by the activation of respiratory chain (NADH oxidation), resulting in ATP increase and amelioration of energy state. The decrease in energy resources at higher temperature was characteristic for both genders. We determined the correlation between the viability of hepatocytes, NAD(P)H fluorescence and chromatographically defined NAD(P)H amount. We showed the liver surface NAD(P)H fluorescence to be directly dependent on NAD(P)H amount. It can be presumed that non-invasive direct measurement of NAD(P)H fluorescence can be a valuable marker of hyperthermia-induced viability changes.